磷酸鈣轉(zhuǎn)染法
材料：
質(zhì)粒DNA
指數(shù)生長(zhǎng)的真核細(xì)胞
2 M CaCl2
2×HBS （pH 7.05）
配方:
2×HBS （pH7.05）：900 ml 超純水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214
g，Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g，調(diào)pH 至7.05，定容至1 升，過(guò)濾（0.2 μm 濾
膜）后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?br />方法：
1. 細(xì)胞分盤(pán)： 通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)耐耆�培養(yǎng)基以1×105 至4×105
細(xì)胞/cm2 的密度平鋪細(xì)胞于60 mm 組織培養(yǎng)皿上（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿，
使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的40－70％）。將細(xì)胞置于含5％
CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h 換
液（用4 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。
注：為得到較高的轉(zhuǎn)染效率，盡量使用指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的密度不
超過(guò)80％。
2. 制備磷酸鈣－DNA 沉淀：以60 mm 組織培養(yǎng)皿用500 μl 反應(yīng)總體積為例。在
滅菌水中加入質(zhì)粒DNA（總量4－10 μg 為佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三
者總體積達(dá)到250 μl，混勻。將等體積2×HBS 鹽溶液逐滴加入，同時(shí)輕彈管
壁，使每滴加入后及時(shí)混勻。靜置2 min 后，立即將這500 μl 的磷酸鈣－DNA
懸液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動(dòng)平皿混勻。
注：可以觀察到滴入的部位培養(yǎng)基瞬間會(huì)出現(xiàn)渾濁的橘黃色，應(yīng)盡快將其混勻，
避免形成過(guò)大的顆粒，影響轉(zhuǎn)染效率。
3．若轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不用轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑處理，則置于含5％ CO2 的37℃溫箱孵育。8 h
后吸去培養(yǎng)基與DNA 沉淀，加入5 ml 37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細(xì)胞放
置溫箱孵育，16-40 h 觀察其轉(zhuǎn)染效率。
參考：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版（p1284～1285）

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