IMD對缺血-再灌注心肌保護ATP敏感性鉀通道的作用研究
衛(wèi)雷 成尚霖 馬捷

【摘要】目的 觀察心肌缺血期處理后在體大鼠心肌缺血- 再灌注損傷中中介素(Intermedin IMD) 參與情況下的保護機制 ； 研究IMD對心肌細胞的保護作用是否途經(jīng)ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)，為探討心肌保護機制提供臨床思路。方法 選取標準SD 大鼠45 只，隨機分為缺血再灌注組(I/R 組)、IMD 治療組(IMD 組)、格列本脲+IMD 治療組(Gli+IMD 組)，每組15 只。各組分別于再灌注末期分別抽取動脈血3ml，用比色法測定血清CK 和LDH，用ELISA 法測cTnI活性。取心尖部心肌組織，10% 甲醛液固定，石蠟包埋，后在光鏡下觀察心肌損害程度。結(jié)果 IMD 組與I/R 組比較，P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組、IMD組比較，P <0.05。結(jié)論 IMD在心血管系統(tǒng)中具有保護作用且其機制可能與其激活了ATP敏感性鉀通道相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】ATP 敏感性鉀通道；缺血再灌注；IMD；心肌保護 doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.22.0010
【中圖分類號】R364.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-5552(2011)22-0021-02


缺血性心臟病(IHD) 已成為西方國家人口死亡的重要原因， 在我國已經(jīng)上升至人口死亡原因的第二位[1]。關(guān)于IHD 的治療首先是恢復(fù)血液灌注，其目的在于解除組織的缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足的狀態(tài)，以阻止缺血性損傷的發(fā)展或促使其恢復(fù)[2]。在對缺血再灌注(Ischemia-reperfusion injury I/R) 損傷的機制研究中，中介素(Intermedin IMD) 也稱腎上腺髓質(zhì)素2(ADM-2)，是 2003 年至今新近確認的降鈣素基因相關(guān)肽超家族成員，廣泛表達于嚙齒類動物大腦、垂體、腎臟、心臟、肺臟、胃腸道、卵巢，血管內(nèi)皮細胞[3]。IMD 同家族成員如ADM和CGRP具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對多個器官系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，已被諸多文獻證實具有很強的心血管保護作用。IMD 是一種新的內(nèi)源性抗損傷保護物質(zhì)，可能作為心血管疾病防治的新靶點[4,5]。因此，IMD 在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用及其機制值得進一步研究。

1材料與方法
1.1實驗動物
選用雄性SD大鼠45 只，體重240-300g( 由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，在常規(guī)條件下飼養(yǎng)，普通飲食，自由飲水。
1.2藥品、試劑和儀器
IMD( 美國Phoenix 公司)、格列本脲( 上海研域化學(xué)試劑有限公司)，cTnI 試劑盒(Biosource 公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK) 試劑盒( 上海恒遠生化試劑有限公司) ；微型動物呼吸機( 浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實驗廠) ；心電圖機( 上海奧爾科特生物科技有限公司)。
1.3I/R 模型的制備
大鼠稱重后以20% 烏拉坦溶液(4ml/kg) 腹腔注射麻醉，仰臥固定，將心電圖針狀電極插入大鼠四肢皮下，描記肢體Ⅱ?qū)��?lián)心電圖。常規(guī)左側(cè)胸前區(qū)備皮，頸正中切開皮膚，鈍性分離頸前肌，氣管切開置管，連接微型動物呼吸機控制呼吸 ；分離出右頸總動脈，用于插管采集血液樣本。沿胸骨左緣第4、5 肋間順勢剪開心包，充分暴露心臟及左心室表面血管，以左冠狀動脈前降支(LAD) 為標志，在左心耳根部下方0.3-0.4cm 處進針，6/0 絲線( 結(jié)扎線) 穿過心肌組織在肺動脈圓錐旁出針，結(jié)扎線兩端分別套入絲線環(huán)作為再灌注拉線，收緊結(jié)扎線使左冠脈前降支閉塞30min，以造成心肌缺血。成功標志為 ：心電圖ST 段弓背向上抬


作者單位：030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心胸外科
作者簡介：衛(wèi)雷(1985-)，男，碩士學(xué)歷。Email：ownfight@163.com通訊作者：馬捷

高和結(jié)扎線以下血管支配區(qū)表面顏色由正常變蒼白再變青紫示為心肌缺血。牽拉再灌注拉線使結(jié)扎線放松后恢復(fù)血流即行再灌注2h，造成I/R 模型。
1.4分組及給藥方法
大鼠分組 ：缺血再灌注組、IMD 治療組、格列本脲+IMD 治療組三組。試驗給藥 ：(I/R) 組即MI 后5min靜滴生理鹽水至實驗結(jié)束 ；(IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg，加入生理鹽水250ml靜滴至實驗結(jié)束 ；(Gli+IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg 加入生理鹽水250ml同時加入格列本脲10μmol/L 靜滴至實驗結(jié)束。給藥滴速均控制在0.5ml/min。
1.5檢測及觀察
各組在造模時分別抽取動脈血3ml至于抗凝離心管中，用2000r/min 離心10min，取上清液，用ELISA 法測cTnI，用比色法測定血清CK 和LDH 活性。
心肌HE病理組織學(xué)染色 ：實驗完畢后取心尖部約100mg 心肌組織，吸水紙脫水固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，從各組中取10 張石蠟切片，二甲苯透明處理，免疫組化HE 染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)變化。
1.6統(tǒng)計學(xué)分析
實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差( ±s)表示，統(tǒng)計學(xué)檢驗應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，P <0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果
2.1各組血清心肌酶比較
與I/R組比較，IMD 組的cTnI、LDH、CK 均下降(P <0.01)； 與IMD組比較，Gli+IMD 組的cTnI、LDH、CK均升高(P <0.05)。見表1：


組別 n LDH(U/L) CK(U/L) cTnI(μg/L) I/R 組 15 982.56±83.24 96.16±8.74 1246.06±82.74
IMD 組 15 456.60±54.32▲ 60.32±5.51▲ 879.09±53.20▲
Gli+IMD 組 15 678.33±34.51★ 79.59±6.50★ 1038.05±63.65★
IMD 組與I/R 組比較，各指標▲ P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組比較，各指標★
P <0.05；Gli+IMD 組與IMD 組比較，★ P <0.05

2.2各組心肌形態(tài)學(xué)改變
光鏡下I/R組主要表現(xiàn)為胞漿嗜酸性變性，可見廣泛大面積呈紅染，心肌橫紋不清甚至消失，心肌纖維呈波浪狀或斷裂融合，

22 基礎(chǔ)研究 中國醫(yī)療前沿 2011年11月 第6卷 第22期 National Medical Frontiers of China, Nov.2011, Vol.6 No.22


肌漿多為不規(guī)則粗顆粒，有明顯細胞壞死表現(xiàn)，間質(zhì)可見充血、水腫、出血以及嗜中性粒細胞浸潤 ；IMD 組心肌組織細胞胞核大小分布均勻, 胞漿嗜酸性變，心肌纖維輕度拉長、變細，偶見成纖維細胞及炎細胞浸潤 ；Gli+IMD 組心肌纖維拉長明顯，心肌纖維呈波浪狀、排列紊亂不規(guī)則，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎細胞浸潤。

3討論
IMD 抑制I/R 損傷是一個復(fù)雜的病理過程，自由基生成增多和細胞內(nèi)鈣超載是I/R損傷發(fā)病的主要機制[6]，文獻報道ADM可通過抑制氧化應(yīng)激和降低鈣超載以拮抗心肌I/R損傷且實驗觀察到IMD1-53 再灌注具有與ADM相似的減少缺血心肌脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物生成的效應(yīng)[7,8]。研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠左心室IMDmRNA 表達明顯升高，推測IMD 的表達增高是由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致[9]。
ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel， KATP) 是受細胞內(nèi)ATP 濃度調(diào)控的一種內(nèi)向整流鉀通道，正常情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，在組織缺血、缺氧或能量耗竭時被大量激活。近年來研究發(fā)現(xiàn)，KATP 通道的激活可調(diào)節(jié)細胞缺血、缺氧反應(yīng)，介導(dǎo)并參與細胞或組織器官的保護作用，它可能是心肌保護效應(yīng)的一個共同通路、啟動因子或終末效應(yīng)器，KATP 的開放能減少線粒體內(nèi)鈣釋放、維持缺血/ 低氧后線體粒的穩(wěn)定性，延緩或減輕缺血/ 低氧后的細胞凋亡[10]。
宋君秋等[11] 研究表明IMD具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，其機制可能與增加抗凋亡蛋白表達和降低氧化應(yīng)激損傷減少線粒體釋放細胞色素C到胞漿，抑制線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細胞凋亡有關(guān)。齊永芬[12] 通過試驗總結(jié)出IMD通過抑制ERS和氧化應(yīng)激改善心肌I/R 損傷。綜上諸多研究發(fā)現(xiàn)，IMD 在保護細胞損傷、抑制凋亡、減輕氧化應(yīng)激等方面有著突出的優(yōu)勢。研究證實， IMD可通過減少局部活性氧(ROS) 的含量減輕心臟缺血再灌注損傷[13]。IMD 通過G蛋白的介導(dǎo)對門控K+ 通道進行調(diào)節(jié)，也是其發(fā)揮效應(yīng)的一種方式[14]。這在IMD 的擴血管及調(diào)節(jié)心肌收縮等方面有重要作用。
研究通過對大鼠心肌缺血再灌注損傷造模觀察心肌肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH) 及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)，檢測三組血清心肌損傷指標含量評定心肌缺血損傷的程度。結(jié)果顯示，在IMD 干預(yù)后，IMD 組較I/R 組的CK、LDH 及cTnI 含量降低，鏡下心肌壞死的損傷病變輕微，提示IMD 可減輕心肌細胞的I/R 性損傷，證實其具有心肌保護效應(yīng)。同時用格列苯脲+IMD 干預(yù)I/R，結(jié)果顯示Gli+IMD 組較IMD 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量升高，鏡下心肌壞死較為明顯，提示格列苯脲取消了IMD 的保護作用，進一步表明心肌KATP 通道參與了IMD 的心肌細胞保護效應(yīng)，為臨床研究心肌細胞缺血再灌注損傷的作用機制提供重要實驗依據(jù)。此外，研究還提示， Gli+IMD 組較I/R 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量降低，說明格列苯脲雖然一定程度上阻斷了IMD 對I/R 心肌細胞損傷的保護效應(yīng)，但其心肌保護作用并沒有完全被阻斷，表明IMD 對I/R 心肌細胞損傷的保護效應(yīng)可能還存在其它機制，諸如通過激活其受體系統(tǒng)和cAMP、NO 途徑等發(fā)揮作用[15]，還有待進一步深入研究。
可見，IMD在心肌細胞缺血再灌注損傷中對參與激活A(yù)TP 敏感性鉀通道有一定的關(guān)聯(lián)，它具有心肌細胞保護作用，深入研究對于防治心血管疾病具有重要意義。

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