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晨時(shí)解讀:ELISA技術(shù)培訓(xùn)之檢測(cè)樣品的處理技巧

點(diǎn)擊次數(shù)：14851 發(fā)布時(shí)間：2018/10/24 10:22:03

ELISA實(shí)驗(yàn)的效果可不能完全依賴試劑盒產(chǎn)品，在我公司保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，您還需要注意保存、樣本、操作等等。今天上海恒遠(yuǎn)帶您來(lái)看ELISA技術(shù)培訓(xùn)之檢測(cè)樣品的處理技巧！供參考。

一、細(xì)胞裂解液
① 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來(lái)。懸浮細(xì)胞可省略。
② 收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。
③ 加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細(xì)胞。通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。
④ 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。
⑤ 4℃10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

二、血清
這是*常用于ELISA檢測(cè)的一類樣本，處理也比較簡(jiǎn)單。
用無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，使血清析出。(將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出)4℃1000×g離心20分鐘，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
采血過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測(cè)中會(huì)有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測(cè)的不準(zhǔn)確性。同時(shí)也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性。

三、血漿
用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測(cè)時(shí)還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書，檢查試劑盒是否對(duì)抗凝劑有特殊要求。

四、細(xì)胞培養(yǎng)上清
取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

五、組織勻漿液
① 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。
② 將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分
③ 將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿，勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，檢測(cè)后計(jì)算樣品濃度時(shí)應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))
④ 吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

六、尿液、唾液等其他液體生物樣本
1000×g離心20min，取上清即可檢測(cè)。
總的來(lái)說(shuō)，因?yàn)镋LISA只能檢測(cè)可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。
為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

*后，上海恒遠(yuǎn)提醒您，還要保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司