假期歸來上海恒遠告訴您TUNEL技術(shù)服務(wù)主要內(nèi)容包括：

一、服務(wù)項目簡介
    TUNEL細胞凋亡檢測(TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品，經(jīng)過生物素標(biāo)記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細胞。
    細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。 基因組DNA斷裂時，暴露的3＇-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin 結(jié)合，*后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細胞。

二、技術(shù)步驟
    1.材料與試劑(以Promega試劑盒為例)，包括：
    ①生物素標(biāo)記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標(biāo)記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/μL
    ②TdT酶(25U/μL)
    ③反應(yīng)緩沖液
    ④洗滌緩沖液
    ⑤異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗體(1：30)
    ⑥PI染液(含PI 5μg/mL及無DNA酶活性的RNA酶0.1%)
    ⑦PBS緩沖液
    ⑧塑料蓋玻片
    2.樣品
    ①懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片
    ②貼壁生長的培養(yǎng)細胞
    ③冰凍切片
    ④常規(guī)石蠟切片
    3.操作方法
    ①固定：培養(yǎng)細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h(-20℃)。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。
    ②洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次。
    ③反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加反應(yīng)液(每50μL反應(yīng)液含TdT酶0.5μL,標(biāo)記的-dUTP 1μL)，使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。
    ④終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌兩次，每次5min。
    ⑤FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液(含F(xiàn)ITC 2.5μg/mL)，室溫下避光孵育10min。
    ⑥洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。
    ⑦PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色30min。
    ⑧封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。
    4.結(jié)果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發(fā)光(波長488nm)，所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光。

三、應(yīng)用領(lǐng)域
    細胞凋亡(apoptosis)的分析方法，細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內(nèi)的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA段的產(chǎn)生。
四、服務(wù)周期
    1.交貨時間： 15~20天
    客戶須知(對材料的要求、注意事項)
    2.結(jié)果提供：正常和陽性對照玻片及其1張數(shù)碼照片，剩余石蠟塊，檢測報告； 
    3.樣本要求：取材保持組織新鮮(組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜(，立即放入固定液中(固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液，體積為組織塊的10倍以上)，避免干燥；對于有血跡的樣本，可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中；經(jīng)固定后的樣本必須在48小時內(nèi)處理。

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原創(chuàng)作者：上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司