一、試劑的選擇優(yōu)良的檢測試劑對于結(jié)果準(zhǔn)確的必要性不容置疑。注意操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，試驗(yàn)前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
二、加樣
（一）可能出現(xiàn)的問題
1．血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣或者待檢標(biāo)本污染或溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
2．手工操作中，加樣板過多造成加樣后放人孵箱前等待時(shí)間長（特別是室內(nèi)溫度較高時(shí)），或者加樣不準(zhǔn)確，各孔標(biāo)本或試劑含量有差別。
3．加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出。
（二）解決方法
1．可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（如唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。標(biāo)本為血清：將血液先于室溫放置1-2小時(shí)后，再用3000r／min離心lO分鐘；標(biāo)本若為血漿，必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時(shí)間后，3000r／min離心15分鐘。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測，如在冰箱中保存過久，其中的蛋白質(zhì)可發(fā)生聚合，在間接ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4~C，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻，宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和。
2．在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣后及時(shí)放入孵箱溫育。
3．從冰箱中取出的試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。
4．標(biāo)本較多時(shí)，請分批操作。
三、孵育
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后�？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育。此過程中可能出現(xiàn)的問題有：孵育時(shí)未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)．吸附于孔壁，難于清洗徹底。故應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間，應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，如果孵育時(shí)間人為延長，將導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍難以徹底清洗。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板。
四、洗板
洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。采用手工洗板時(shí)，孔與孔之間液體交叉。采用半自動洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液量不足可能導(dǎo)致洗板不徹底；洗板針堵塞，可能導(dǎo)致抽吸不完全；洗板不暢可能導(dǎo)致洗板效果差；反應(yīng)板過多可能導(dǎo)致洗板等待時(shí)間長。以上情況均可造成結(jié)果誤差，解決的方法是保證洗液注滿各孔，洗板釘暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無塵的吸水材料）上輕輕拍干；合理安排洗板時(shí)間，交替操作。
五、顯色
顯色是ELISA中的*后一步溫育反應(yīng)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。顯色劑盡量在臨用前配制，不用過期顯色劑肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑堅(jiān)決不用；當(dāng)室溫較低時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長顯色時(shí)間；加樣時(shí)保持顯色劑不外流以免造成液體回流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
六、終止
加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡，會導(dǎo)致假陽性增加，在操作中加以注意就能避免。
七、讀板
讀板時(shí)板底如不清潔也可能造成讀數(shù)不準(zhǔn)。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器l5～3O分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 此外，整個(gè)操作過程中應(yīng)保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸等腐蝕性物品。如有條件實(shí)現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化，可以有效提高檢測質(zhì)量。在實(shí)際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作，同時(shí)做好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本，才能保證檢測質(zhì)量�，F(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動酶標(biāo)儀，這對于實(shí)現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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